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电荷耦合器件 (CCD) 相机为现代科学成像奠定了基础，并在过去几十年中为显微镜和光谱学领域的灵敏度和图像质量制定了标准。这其中包括专门的 CCD 技术，例如 EMCCD，这种技术是为满足最低光照应用而开发的。
与此同时，在过去的十年里，sCMOS 相机已成为许多科学成像应用的主要探测器技术。凭借速度快、噪声低和大视场等优点，sCMOS 重塑了显微镜和定量成像技术，并将大多数传统 CCD 挤出了市场。但有一种特殊的 CCD 仍然非常重要：电子倍增 CCD（EMCCD）。
但是，为什么在 sCMOS 技术不断进步的情况下EMCCD 相机仍然很重要？
在本文中，我们将重点介绍您可能不知道的关于 EMCCD 的 10 件事，解释它们的独特功能以及它们在哪些情况下仍然优于市面上最先进的 sCMOS 。
弱光成像的检测极限主要取决于相机的噪声基底，在低于一秒的短曝光时间内，噪声基底主要由读出噪声决定。尽管现代 sCMOS 相机的读出噪声越来越低，有时甚至低至 1 e⁻ rms，但在共聚焦、TIRF 和其他光照不足的应用中，EMCCD 相机对于表达量低或丰度低的荧光团仍然具有更优异的检测性能。
EMCCD 是如何达到这种灵敏度的？
EMCCD 传感器集成了一个额外的电子倍增（EM）增益寄存器，它的可控高压脉冲可将信号放大几个数量级。这种放大作用使信号远高于后续读出过程中引入的读出噪声，从而使读出噪声相对于放大后的信号可以忽略不计。
EMCCD 传感器的串行读出架构还能确保高度均匀的像素响应，最大限度地减少固定模式噪声，而当 sCMOS 传感器在其检测极限附近工作时，固定模式噪声可能会成为问题。
EMCCD 在哪些应用中能真正发挥作用？
诸如 iXon Ultra EMCCD 之类的 EMCCD 相机具有独特的光子计数功能，能够以极高的概率探测到单个光子。这使得它们特别适用于生物物理学和量子研究，因为这些领域的实验通常在极低的光通量下进行，有时甚至低至每个像素只有一个光子。因此，EMCCD 技术仍然是需要单光子灵敏度的首选。
与 sCMOS 传感器相比，EMCCD 相机的像素尺寸相对较大，这在其高灵敏度方面起着至关重要的作用。简而言之，更大的像素意味着更大的光子收集面积，可以捕获更多的光子，从而实现更高的信噪比。
像素尺寸的差异在实际应用中意味着什么？
EMCCD 相机的像素尺寸通常为13 或16 微米，而大多数常用的 sCMOS 传感器的像素尺寸为 6.5 微米或更小。EMCCD 像素尺寸较大的缺点是空间采样率较低，这意味着在较低放大倍率（例如40 倍或20 倍）下使用时，像素过大而无法提供精细的细节。因此，在需要大视场范围内呈现精细细节的情况下，sCMOS 通常是更好的选择。
EMCCD 相机则针对高倍率、光线不足的应用（例如单分子生物物理学和共聚焦显微镜中的弱荧光标记）中的光子收集进行了优化。
虽然 EMCCD 相机通常被描述为具有“几乎为零”的读出噪声，但其实际读出噪声可能相对较高，通常在 100 – 180 e⁻ 范围内，而现代 sCMOS 传感器的读出噪声约为 1 e⁻ rms。
EMCCD 相机在灵敏度方面仍然优于 sCMOS 的原因在于 EM 增益寄存器。
电磁增益如何影响读取噪声？
在 EMCCD 读出之前，输入信号经由电磁增益寄存器放大几个数量级。这种放大作用将信号提升到一定水平，使得读出噪声（尽管仍然存在，并且高于sCMOS 的读出噪声）相对于放大后的信号可以忽略不计。因此，已发表的文献估计，EMCCD 有效读取噪声（最终限制检测性能的参数）低于 0.3 e⁻ rms。
随着帧率的提高和曝光时间的缩短，到达传感器的光子数量减少，使得传统高速探测器越来越难以获得足够的信噪比。EMCCD 相机在高帧速率下仍能保持有效的灵敏度，因为电磁增益放大技术可以提高信噪比，从而能够检测到非常微弱的信号。
这使得 EMCCD 技术特别适用于动态、低光照应用，例如神经成像和蛋白质-蛋白质相互作用研究。
为什么与 EMCCD 相机相比，使用 sCMOS 相机实现高灵敏度和高速成像更具挑战性？
在快速、低光照实验中，可用光子数量少，信号强度往往低于高速 sCMOS 相机的检测极限。此外，sCMOS 传感器在最高速模式下运行会显著提高其噪声基底，增加像素异常行为，并降低动态范围。
裁剪或 ROI 等技术可以提高检测器的性能，但并不总是足以达到可靠分析所需的信噪比水平。
相比之下，EMCCD 中的电磁增益寄存器可以在读出前放大少量光子，而不会相应增加噪声。这使得即使在光子数量极其有限的条件下，也能以高帧速率进行有效检测。EMCCD 相机提高帧速率的唯一代价是视场角减小。
EMCCD 传感器采用特殊涂层，可在蓝光到近红外（NIR）波段实现高量子效率。相比之下，sCMOS 相机通常针对常用荧光染料（例如 GFP）进行优化，其峰值灵敏度范围为 460-620 nm，超出此范围响应迅速下降。
哪些应用需要具有扩展蓝光和近红外灵敏度的 EMCCD ？
对于需要在可见光范围之外获得高灵敏度的应用，EMCCD 技术仍然是首选。增强的红色灵敏度对于成像较厚的组织尤为有利，因为减少散射和降低自发荧光至关重要。诸如 iXon Ultra EMCCD 相机之类的 EMCCD 提供定制的传感器涂层，可增强从蓝色到近红外波段的检测能力。
最近推出的 iXon Ultra Blue 可在光谱的蓝区提供卓越的性能，支持离子阱量子计算等要求高短波响应的应用。
EMCCD 摄像机刚问世时，人们对这项新技术提出了两个主要担忧：
这些问题在 iXon EMCCD 相机中已得到彻底解决。
iXon EMCCD 相机如何保证 EM 增益线性度和长期稳定性？
电磁增益线性度
RealGain™ 通过将真实的电磁增益（定义为绝对信号倍增因子）精确映射到摄像机输出，确保了精确的电磁增益线性度。这提供了长期稳定可靠的性能。
EM增益老化
iXon EMCCD 相机采用专有设计，将电磁增益漂移降至极低水平，使其在正常工作条件下几乎可以忽略不计。经过 20 多年的高强度使用，数千台 iXon EMCCD 相机从未因电磁增益老化而无法使用。
提高成像速度是常见的实验需求，而减小有效成像区域是提高帧速率而不影响灵敏度和其他成像参数的常用方法。除了标准的数字裁剪之外，iXon EMCCD 相机还提供光学掩模功能，通过限制传感器本身的照明区域来进一步提高速度。
光学掩蔽与传统传感器裁剪有何不同？
数字传感器裁剪是一种众所周知且非常有效的提高 sCMOS 和 EMCCD 相机成像速度的方法。可达到的帧速率取决于数据速率是受限于传感器、计算机的数据接口（例如 USB 或 CoaXPress）还是相机的数字化速率（例如8位、12位或16位数据）。
光学掩蔽是一种鲜为人知的技术，它通过物理方式阻止光线到达感兴趣区域 (ROI) 以外的传感器区域，从而实现更高的帧速率。在 iXon EMCCD 相机中，这项技术通过一种名为“ OptoMask ”的器件来实现，与标准裁剪模式相比，在某些 ROI 尺寸下，该器件可以将帧速率提高至三倍。
由于 EMCCD 相机通常与先进的成像系统相关联，且设置范围更广，因此人们有时会认为 EMCCD 相机比 sCMOS 相机更复杂。然而，实际上，像 iXon Life 888 这样的现代 EMCCD 相机的操作难度并不比其他科学相机高多少，日常使用只需考虑少数几个关键参数。
为什么 EMCCD 看起来很复杂，有效使用它们实际上需要什么？
人们感知到的 EMCCD 相机的复杂性，大多源于整个成像系统以及相机参数在采集软件中的实现方式，而非相机技术本身。需要理解的主要参数是电磁增益，只需将其设置为合适的水平即可。
一般来说，EM 增益应设置为读出噪声的四到五倍左右，对于大多数荧光显微镜应用而言，通常对应于 250 到 400 之间的值。EM 增益设置好后，即可调整曝光时间以获得所需的图像质量。
如果电磁增益过低，信号强度将不足以远高于噪声基底，从而降低图像质量和检测效率。选择高于实际需要的电磁增益会降低动态范围，但不会损坏传感器。
如何进一步简化EMCCD的设置？
牛津仪器公司的 OptAcquire 功能可以根据应用自动配置多个 EMCCD 参数，例如优化设置以获得最大速度或最高灵敏度。
不同的成像方式对探测器性能的要求截然不同。基于荧光的成像通常只需要50-500 毫秒的短曝光时间，而基于发光的成像则需要从几秒到几分钟不等的较长信号积分时间。这些截然不同的要求通常意味着需要针对不同的应用使用不同的相机。
sCMOS 相机针对灵敏度和高速成像进行了优化，因此非常适合短曝光成像。然而，即使是像 Sona-6 Extreme 这样采用深度冷却技术的型号，热噪声也会将曝光时间限制在10到20秒左右。
相比之下，iXon Ultra EMCCD 等 EMCCD 相机可以配置为两种不同的工作模式。对于快速荧光成像，它提供高速读出和 EM 增益，从而在短曝光时间内最大限度地提高灵敏度。对于长时间曝光实验，该相机可以工作在慢扫描 CCD 模式下，结合深度冷却技术，可最大限度地降低热噪声，并在发光实验中实现最佳性能。
因此，iXon Ultra 具备“二合一相机”的灵活性，既可用于快速成像，也可用于慢速、长时间曝光实验。
所有 EMCCD 摄像机都可以在 CCD 模式下运行吗？
不。虽然任何 EMCCD 的电子倍增增益都可以设置为1（EM增益=1），但这并不意味着所有 EMCCD 都适合作为传统 CCD 使用。CCD 模式通常需要传感器设计中配备一个独立的传统输出放大器来旁路EM增益寄存器，因为在较长时间尺度下，EM 增益寄存器可能会引入额外的噪声源。因此，只有专为长时间曝光应用而设计的 EMCCD 才能提供真正的 CCD 模式性能。
iXon Ultra EMCCD 包含一个专用的 CCD 模式，非常适合长时间曝光成像。它还配备了机械快门，有利于控制到达传感器的光线，并实现精确的背景扣除。其他型号不具备此功能。
请注意，iXon Life EMCCD 不包含 CCD 模式或机械快门，因为该产品系列专门针对需要 EMCCD 操作的荧光显微镜应用进行了优化。
EMCCD 相机有时被认为是一种成熟甚至过时的技术。但实际上，EMCCD 仍然是一种积极发展的探测器技术，其性能、易用性以及针对需要极高灵敏度测量的应用优化都在不断改进。
EMCCD性能的哪些方面仍需改进？
随着时间的推移，EMCCD 的发展重点一直放在优化关键参数上，例如灵敏度、速度、稳定性、光谱响应和易用性。iXon 897 就是这一持续演进的鲜明例证，它是全球安装量最大的 EMCCD 相机。尽管相机名称基本保持不变，但历次更新不断提升了读取速度、灵敏度和图像质量，而且这种优化仍在继续。
近期发展如何拓展了 EMCCD 的应用？
iXon Life系列产品将 EMCCD 的成本降低到接近背照式 sCMOS 探测器的水平，代表着生命科学市场的一项重大进步。这使得更多用户和实验室能够使用 EMCCD 技术。
最近推出的 iXon Ultra Blue EMCCD 在光谱的蓝色区域实现了卓越的检测效率，满足了离子阱量子计算等应用的新兴需求。
这些发展共同凸显了一个关键点：EMCCD 技术随着科学需求的不断发展而持续进步，并且对于对灵敏度和光谱性能要求极高的应用仍然具有很高的相关性。
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