基于转盘共聚焦进行高分辨率延时成像

旋转盘共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用

莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系（CCB-LUMC）致力于揭示细胞功能的分子基础，并理解这些基础在疾病中的变化。该系的终旨是将新兴的知识和技术转化为临床实践。为了实现这一使命，其研究范围从对细胞生物学过程的基本理解扩展到对复杂细胞系统（如类器官和组织）的化学操作，为疾病干预铺平道路。这些研究涵盖了生命科学的多个领域，包括病毒和膜生物学、化疗药物的细胞生物学、癌基因信号传导、糖尿病中的抗原呈递等。

研究相关分子机制的首选方法是使用共聚焦显微镜进行活细胞成像。ANDOR Dragonfly转盘共聚焦成像系统在LUMC细胞与化学生物学系的多个研究项目中被广泛使用。CCB就是利用时间序列显微镜来理解细胞生物学过程以及细胞、细胞器和分子的时空行为，这比使用固定样本能够获取更丰富的信息。

CRISPR介导的敲入技术正迅速成为标准策略，当它与共聚焦的时间序列成像协同应用时，便可在活细胞中观察内源性荧光标记蛋白。然而，由于敲入受内源性启动子限制，荧光蛋白的表达水平通常较低，特别是与异位（过度）表达水平相比。因此，CRISPR敲入分析需要一台能够提供极其灵敏检测的显微镜。

此外，细胞器行为和细胞有丝分裂研究还面临着迭代采集速度和光毒性等额外技术的挑战。

"“ANDOR Dragonfly为我们提供了灵敏度、光毒性方面的解决方案，同时不降低采集速度。”"

莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系的Lennard Voortman博士

图1 - 莱顿大学医学中心光学显微镜中心的ANDOR Dragonfly 500

莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系的研究项目

在本节中，我们将概述莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系（CCB-LUMC）的Jacques Neefjes教授和Huib Ovaa教授实验室的几项研究。这些研究从细胞生物学的基本机制到转化研究，都使用了以Dragonfly转盘显微成像为代表的现代显微成像和分子生物学技术（有关Dragonfly转盘共聚焦的概述，请参阅Browne M., 2017）。

研究1）细胞内运动如何调节支持细胞器功能？

细胞器在细胞空间运动的复杂性与其功能密切相关。运动的细胞器（线粒体、内吞体、溶酶体和自噬体）以及感染性病原体（包括细菌和病毒）沿着微管运动。这种运动是由驱动蛋白和动力蛋白-动力蛋白复合体驱动，以双向、走走停停的方式进行。

“仍有几个生物学问题尚未被解答：

• 双向运动究竟需要什么？
• 双向运动如何被调节以支持细胞器功能？”

为了解答这些问题，Neefjes实验室基于CRISPR创建了几种双色敲入的细胞来监测双向运动途径的不同潜在组成部分，包括内源性马达（KIF5和动力蛋白）或晚期内吞体效应蛋白（RILP和FYCO1）。众所周知，晚期内吞体蛋白作用于小GTP酶Rab7的下游。因此，还使用了一个所有囊泡都被标记的细胞系，以便分析细胞中囊泡的“拥挤度”。

本研究项目先对活细胞进行时间序列的显微成像，再进行大量的图像分析。该工作的最终目标是理解细胞生物学中双向细胞器运输的基础。（如图2）

在类似的研究中，还采用特异性靶向去泛素化酶USP32的化学抑制剂与细胞系结合使用，以化学方式干扰细胞内运输途径。去泛素化酶USP32调节Rab7功能（Sapmaz & Berlin等人，2019）。

总之，基于Ovaa实验室的各种化学生物学工具，Neefjes实验室将继续剖析细胞内细胞器双向运动机制。这需要大量的活细胞成像显微镜来推动这个项目向前发展。

图2 - 双向运动和细胞器动态的代表性Dragonfly 500共聚焦图像。左侧：表达mCherry-Rab7或其突变体，以及Arl8b-GFP（绿色）的活HeLa细胞的代表性共聚焦图像。右侧：对Arl8b阳性囊泡进行了50秒的观察。时间序列图像由Dragonfly500采集，对囊泡的动态分析由Fiji的TrackMate分析。图像改编自Jongsma, Bakker et al, EMBO Journal 2020。

研究2）内质网结构如何调节？

内质网（ER）是可以与胞内的细胞器相互作用的中心细胞内室。它是一个复杂的生物合成细胞器，还分泌糖脂和离子，并将钙信号和代谢信息转导至其他细胞器。为了分割和促进这些多样化的功能，ER具有密集的核周部分和管状的外围网络。

这项研究的结果发表在 EMBO Reports (Spits et al., 2021)上，利用Dragonfly转盘共聚焦显微镜获取了近50个动态视频。

研究3）理解细胞分裂过程中细胞器的组织和运动。

内吞体可为成功的胞质分裂和脱落提供至关重要的膜和蛋白成分。Neefjes实验室最近发现了一种嵌入ER嵌入的泛素连接酶，它控制着内溶酶体途径的核周位置（Jongsma & Berlin et al., 2016）。这种控制是货物有效和及时交换的关键。然而，我们预计在有丝分裂中，这种细胞器间的组织（即ER和内吞体之间的相互作用）可能会丧失，以促进细胞质分裂和内溶酶体系统的分配到新生的子细胞。

为了进一步理解有丝分裂期间内吞体（和其它细胞器）的时空组织，以及ER在其中的作用。将基因组编辑技术与转盘共聚焦显微成像技术相结合，能够基于荧光实时跟踪细胞的有丝分裂过程。研究人员Ilana Berlin和Lennard Voortman补充说，“这项研究将需要大量的时间序列成像，Dragonfly共聚焦显微镜在其中发挥重要作用”。

参考文献

• Browne M., (2017) Twelve Reasons Why Your Next Confocal Should Be Dragonfly.
• Sapmaz & Berlin et al., (2019) USP32 regulates late endosomal transportand recycling through deubiquitylation of Rab7 Nature Communications v10 pg 1454
• Spits et al., (2021) Mobile late endosomes modulate peripheral endoplasmic reticulum network architecture Embo Reports e20815
• Jongsma & Berlin et al., (2016) An ER-Associated Pathway Defines Endosomal Architecture for Controlled Cargo Transport Cell v166 pg 152
• Jongsma, Bakker et al., (2020)   SKIP‐HOPS recruits TBC1D15 for a Rab7‐to‐Arl8b identity switch to control late endosome transport EMBO Journal v39 e 102301

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