生命科学
物理科学
牛津仪器集团成员
HeLa细胞通过胸苷双阻断法实现同步化，并在进行抗PCNT免疫染色和PCNT smFISH之前，分别接受了DMSO（对照组）、依米丁（emetine）、三尖杉酯碱（harringtonine）或嘌呤霉素（puromycin）的处理。图中展示了每种条件下代表性的共聚焦图像以及PCNT mRNA分布的量化结果。通过测量3D渲染的PCNT smFISH信号与最近的中心体中心之间的距离，研究人员量化了细胞中PCNT mRNA的分布。随后，将mRNA的分数作为距离最近中心体的函数绘制为均值（实线）±95%CI（阴影），数据来自三次生物学重复。值得注意的是，经过三尖杉酯碱或嘌呤霉素处理后，PCNT mRNA远离中心体，而经过依米丁处理后，与对照组相似，PCNT mRNA仍靠近中心体。图像由加州大学戴维斯分校的Li-En Jao博士提供。
加州大学戴维斯分校的Li-En Jao研究团队正在研究细胞在分裂前如何通过一个中心体成熟的过程迅速扩张其中心体。当这一过程出现异常时，可能会导致基因组不稳定以及在癌细胞中所见的失控的细胞分裂。基于ANDOR Imaris软件和Dragonfly转盘共聚焦成像系统，他们对中心体在细胞分裂过程中如何组织微管有了新的发现。
中心体是一种无膜、自组装的微米级细胞器。在细胞分裂前，中心体会经历“成熟”过程，使其微管组织活性达到支持纺锤体微管组织所需的最高水平。
在研究中，研究人员关心的是中心粒周围蛋白（PCNT），它通过帮助招募其它蛋白质来启动中心体成熟。他们希望进一步了解细胞如何在短短几分钟内产生并输送大量这种大分子蛋白质到中心体。
弱信号成像
为了深入了解PCNT在细胞内的产生位置及其合成过程，研究人员巧妙地将单分子RNA原位杂交（smFISH）技术与抗体染色相结合，从而能够同时检测到PCNT的RNA以及新合成的PCNT蛋白。通过观察RNA与新合成蛋白的共定位情况，研究人员精准地锁定了正在发生翻译的RNA分子。
在实验过程中，研究人员借助了ANDOR Dragonfly（配备了微透镜双转盘共和高灵敏度科学相机的转盘共聚焦显微镜）对培养的人类细胞中的PCNT RNA和蛋白进行了成像。Li-En Jao博士指出：“Dragonfly系统提供了高灵敏度和共聚焦性能来检测到微弱的smFISH信号。它还使我们能够兼顾高灵敏度和高分辨率对PNCT mRNA和蛋白进行成像。”
随后，研究人员利用ANDOR Imaris软件在单细胞水平上量化了PCNT RNA分子相对于中心体的分布情况。他们首先通过Imaris将蛋白信号转化为Surface对象，将mRNA信号转化为不同大小的Spot对象，并在每个共聚焦z堆栈的去卷积图像中对细胞内的RNA分布进行3D量化。接着，研究人员通过将PCNT信号的Surface覆盖在原始图像上，并利用Imaris中的统计功能获取拟合Surface内原始图像的荧光强度总和，从而量化了中心体处的PCNT的总强度。
PCNT的构建与运输同步进行
总之，图像分析揭示了PCNT蛋白在有丝分裂期间是被共翻译募集到中心体的。这意味着细胞利用RNA分子作为模板构建蛋白质，并利用核糖体以正确的顺序组装，从而同时构建和运输PCNT蛋白。
研究人员计划继续利用Dragonfly系统和Imaris软件，探索细胞如何在中心体成熟过程中协调PCNT的共翻译靶向与其它中心体蛋白的招募。
研究人员采用单分子荧光原位杂交（smFISH）和双重免疫荧光（IF）技术，以区分新合成的和全长的PCNT蛋白（图a）。在有丝分裂前期的HeLa细胞中，进行了PCNT smFISH和针对PCNT蛋白N端及C端的抗PCNT免疫染色（图b，上图）。潜在的活跃翻译位点通过PCNT N端IF和PCNT smFISH标记，而不是通过PCNT C端IF标记。经过嘌呤霉素处理后，PCNT N端IF信号不再与PCNT smFISH信号共定位，表明这些位于RNA上的PCNT N端IF信号代表的是新生的PCNT多肽链。橙色框以更高对比度展示了虚线橙色框标记区域。利用Imaris软件可从共聚焦z堆栈图像中，将PCNT蛋白和PCNT mRNA信号分别渲染为“Surface”和“Spot”（图c和d）。研究人员量化了距离中心体中心1到3μm半径范围内的PCNT smFISH信号，并分析了无论是否经过短暂的嘌呤霉素处理，这些信号是否存在抗PCNT N端IF信号，（图e）。这些图像由加州大学戴维斯分校的Li-En Jao博士提供。
欢迎关注牛津仪器
The Business of Science
400 678 0609 | www.oxinst.cn
© 牛津仪器 2025
公安机关备案号31010402003473