克服细胞囊泡运输成像挑战的策略

背景分析

细胞外囊泡与细胞内囊泡在细胞间的交互作用和细胞内部的信号传递中扮演着关键角色。内吞途径的异常调控与多种疾病的发生发展紧密相关，如癌症、糖尿病和心血管等疾病。此外，内吞途径在药物分子的靶向递送方面展现出巨大的应用潜力。因此，对囊泡运输机制和内吞途径的深入研究对于深化我们对这些疾病的认识、指导临床治疗策略的制定以及推动创新药物的开发具有不可估量的重要性。

然而，实现囊泡运输的有效成像充满挑战，研究者必须应对多项难题。囊泡成像面临的主要难题包括如何避免光毒性与光漂白，以及在固定细胞或活细胞成像实验中对快速数据采集和高分辨率成像的需求。这些挑战不仅限于图像获取阶段；图像获取后的囊泡追踪与分析同样是一项技术性极强的工作。在此，我们将探讨囊泡运输成像在速度和分辨率方面的要求。

图1：mCherry-C2β在细胞膜处与F-肌动蛋白共定位，而GFP-C2α偶尔与F-肌动蛋白共定位。

解决方案

采用基于科学相机的共聚焦显微成像系统，为活细胞囊泡的实时成像提供了一种更为理想的解决方案。这种系统在成像过程中能够显著降低光毒性，从而保护细胞的活性不受损害。此外，该设备还应具备快速的图像采集能力和出色的成像分辨率，以确保捕捉到清晰、准确的囊泡动态图像。

• 速度 - 为了同时观察多种囊泡运输过程，我们需要一种能够同时捕获多个通道的仪器。鉴于这些事件的瞬时性，显微镜必须具备极速的图像采集能力。这意味着设备不仅要能够快速响应，还要确保在高速成像的同时，保持图像数据的质量和精确度。
• 分辨率 - 观察细胞内囊泡运输过程，需要的分辨率在XY方向上应达到50至100纳米的精度。然而，传统光学显微镜的衍射极限大约为200纳米，这限制了其对细微结构的观察能力。为了突破这一限制，捕捉到囊泡运输的精细动态，必须采用超越常规衍射极限的超分辨率显微技术。
• 活细胞超分辨率成像技术 - 这些技术旨在超越传统光学显微镜的衍射极限，但它们通常需要捕获成千上万的图像帧（大约10^3到10^4张），或者在高光强度条件下进行成像。此外，样品的制备过程往往非常复杂，并且需要使用特定的荧光标记物。这些苛刻的条件限制了这些技术在活细胞成像中的应用，因为它们很难满足活细胞成像对于保持细胞活性和减少光毒性的要求。
  

牛津仪器ANDOR - 细胞囊泡成像的解决方案

Dragonfly因其速度、灵敏度和分辨率而成为对细胞间转运进行成像的完整解决方案。高灵敏度相机可以检测到具有高量子效率的非常微弱的信号。使用 Dragonfly 和 Andor 的相机（例如背照式 Sona 或 iXon EMCCD 系列），可以实现超快速弱光成像。使用 Dragonfly 可以实现转盘共聚焦、STORM 超分辨率（分辨率 ~ 20 nm）或 B-TIRF（分辨率 ~ 50 nm）等成像模式，并且每种成像模式对于囊泡研究都有优势。重要的是，任何模式都可以与超分辨率技术 SRRF（超分辨率径向波动）相结合。SRRF-Stream 与活细胞成像兼容，具有非常快速的超分辨率活体成像的优势。

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