捕捉动态过程的成像过程中的挑战

背景分析

线粒体作为真核细胞中提供能量的关键细胞器，其功能至关重要。线粒体动力学缺陷与多种急性综合症紧密相连，包括神经退行性疾病、心血管疾病以及神经代谢性疾病，

线粒体的显微观察是一项技术挑战，因为这些细胞器具有复杂的双层膜结构：一层光滑的外膜和一层高度曲折的内膜，这增加了观察的复杂性。线粒体的尺寸微小，接近光学显微镜分辨率的极限，使得其结构细节难以捕捉。此外，线粒体的动态性极高，它们不断地进行分裂、融合、形态变化以及在细胞内空间中迁移。这些特性为实时观察活细胞中的线粒体动态行为，包括其分裂与融合过程，以及其快速信号传导机制，带来了显著的成像难题。

在活细胞线粒体的成像过程中，除了必须面对的光毒性和光漂白等活细胞成像的核心难题外，研究者还需解决其他技术难题。为了捕捉线粒体动态过程的每一个细节，图像的获取必须达到高时间分辨率和空间分辨率。实际上，要全面揭示线粒体的空间结构和时间变化，就需要在四维空间（三维空间加上时间维度）中收集图像数据。即使是对固定后的线粒体进行观察，由于其微小的尺寸和复杂的内部结构，实现高空间分辨率成像也是一项基本而关键的要求。

解决方案

采用基于相机探测的共聚焦显微镜系统进行活细胞线粒体成像，提供了一种在不牺牲细胞活性的前提下，有效减少光毒性影响的先进解决方案。该系统具备快速的图像采集能力和卓越的成像分辨率，以确保能够精确捕捉线粒体的动态变化，同时保持细胞的生理状态。

• 速度 - 在对线粒体动态及钙离子信号进行可视化研究时，研究者需要一种能够同步捕获多个荧光通道的高精仪器。鉴于这些生物学事件的瞬时性，显微镜必须具备极速的数据采集能力，以确保能够实时追踪并记录下这些快速发生的生物学过程。
• 分辨率 - 为了精确观察线粒体的运输过程，所需的空间分辨率必须达到50至100纳米的精度水平。然而，传统光学显微镜的衍射极限约为200纳米，这限制了对细微结构的观察。因此，为了突破这一限制，必须采用超分辨率成像技术，这些技术能够提供超越传统光学分辨率的图像，从而揭示细胞内部更加精细的结构和动态过程。
• 活细胞超分辨率 - 这类技术旨在突破传统光学显微镜的衍射极限，但这类技术往往需要采集大量图像帧（数量级达到10^3至10^4），或在高光照强度下进行成像。此外，样品的制备过程通常较为复杂，并且需要使用特定的荧光标记物。这些技术要求使得现有的大多数超分辨率成像方法难以应用于活细胞的实时观察，因为它们可能对细胞的生理状态造成干扰，影响细胞的活性。

图1 –分别在宽视场、共聚焦和共聚焦+ SRRF stream中拍摄的用MITO Tracker染色的活细胞图像。可以观察到宽视场、共聚焦和共聚焦与SRRF stream 图像之间的分辨率增加。使用具有SRRF stream的Dragonfly ，科学家可以获取线粒体的活细胞超分辨率图像。

Andor的线粒体成像解决方案

Dragonfly以其卓越的速度、灵敏度和分辨率，为活细胞线粒体成像提供了一个全面的解决方案。配备的高灵敏度相机能够以高量子效率捕捉到极其微弱的信号。结合Andor公司的背照式Sona或iXon EM-CCD系列相机，Dragonfly能够实现超快速的低光照成像。此外，Dragonfly支持转盘共聚、dSTORM超分辨率等多种成像模式（分辨率可达约20纳米），每种模式都为线粒体的研究提供了独特的优势。

至关重要的是，SRRF（超分辨率径向波动）技术能够与各种成像模式相结合，极大地扩展了成像的应用范围。SRRF stream技术不仅与活细胞成像兼容，而且还能提供高速的超分辨率活细胞成像能力，这对于捕捉细胞内部动态过程具有显著的优势。

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