生命科学
物理科学
背景分析
线粒体作为真核细胞中提供能量的关键细胞器,其功能至关重要。线粒体动力学缺陷与多种急性综合症紧密相连,包括神经退行性疾病、心血管疾病以及神经代谢性疾病,
线粒体的显微观察是一项技术挑战,因为这些细胞器具有复杂的双层膜结构:一层光滑的外膜和一层高度曲折的内膜,这增加了观察的复杂性。线粒体的尺寸微小,接近光学显微镜分辨率的极限,使得其结构细节难以捕捉。此外,线粒体的动态性极高,它们不断地进行分裂、融合、形态变化以及在细胞内空间中迁移。这些特性为实时观察活细胞中的线粒体动态行为,包括其分裂与融合过程,以及其快速信号传导机制,带来了显著的成像难题。
在活细胞线粒体的成像过程中,除了必须面对的光毒性和光漂白等活细胞成像的核心难题外,研究者还需解决其他技术难题。为了捕捉线粒体动态过程的每一个细节,图像的获取必须达到高时间分辨率和空间分辨率。实际上,要全面揭示线粒体的空间结构和时间变化,就需要在四维空间(三维空间加上时间维度)中收集图像数据。即使是对固定后的线粒体进行观察,由于其微小的尺寸和复杂的内部结构,实现高空间分辨率成像也是一项基本而关键的要求。
解决方案
采用基于相机探测的共聚焦显微镜系统进行活细胞线粒体成像,提供了一种在不牺牲细胞活性的前提下,有效减少光毒性影响的先进解决方案。该系统具备快速的图像采集能力和卓越的成像分辨率,以确保能够精确捕捉线粒体的动态变化,同时保持细胞的生理状态。
图1 –分别在宽视场、共聚焦和共聚焦+ SRRF stream中拍摄的用MITO Tracker染色的活细胞图像。可以观察到宽视场、共聚焦和共聚焦与SRRF stream 图像之间的分辨率增加。使用具有SRRF stream的Dragonfly ,科学家可以获取线粒体的活细胞超分辨率图像。
Andor的线粒体成像解决方案
Dragonfly以其卓越的速度、灵敏度和分辨率,为活细胞线粒体成像提供了一个全面的解决方案。配备的高灵敏度相机能够以高量子效率捕捉到极其微弱的信号。结合Andor公司的背照式Sona或iXon EM-CCD系列相机,Dragonfly能够实现超快速的低光照成像。此外,Dragonfly支持转盘共聚、dSTORM超分辨率等多种成像模式(分辨率可达约20纳米),每种模式都为线粒体的研究提供了独特的优势。
至关重要的是,SRRF(超分辨率径向波动)技术能够与各种成像模式相结合,极大地扩展了成像的应用范围。SRRF stream技术不仅与活细胞成像兼容,而且还能提供高速的超分辨率活细胞成像能力,这对于捕捉细胞内部动态过程具有显著的优势。
核心需求 | 线粒体成像方案:Dragonfly系统配合Andor高量子效率(QE)相机 |
极速成像捕捉 |
Dragonfly系统搭载的EMCCD和sCMOS探测器,使得该设备能够在极低光照条件下进行成像,并实现超快速的数据采集能力。与传统的点扫描共聚焦系统相比,Dragonfly的成像速度快了至少十倍。其系统内部的分光器设计巧妙,能够同时在两个独立的探测器上捕获两个不同的通道。这带来了两个显著的结果: 1、能够以每秒高达400帧的速度捕捉到转瞬即逝的生物学事件; 2、能够在不降低成像速度和分辨率的前提下,同时监测两个独立的荧光通道。 |
实现纳米级分辨率成像 |
Dragonfly成像系统兼容dSTORM(直接随机光学重聚焦显微镜)技术,这一技术能够显著提升成像的分辨率。系统内置的电动散光透镜通过在轴向上调整焦点,对单分子PSF进行校准,产生不对称的畸变。这一创新设计带来了两个显著的成果: 1、通过dSTORM技术,成像分辨率可达到20纳米级别; 2、结合dSTORM与散光透镜技术,Dragonfly能够捕获三维超分辨率图像。 |
捕捉实时超分辨率图像,分辨率可达100纳米 |
Andor公司的相机配备了SRRF技术的集成许可,这项技术通过分析荧光团发射的自然波动,并进行智能插值,有效提升了光学成像系统的分辨率。其内置的SRRF stream算法不仅支持实时处理,还能即刻展示分辨率的显著提升。SRRF技术的另一大优势是它与常规荧光团的兼容性,简化了样品准备流程。此外,SRRF技术能够与多种成像模式如共聚焦、全内反射荧光(TIRF)以及宽场成像相结合,甚至适用于深层成像。具体成果表现在: 1、SRRF stream技术能够将分辨率提升至2至6倍,实现50至150纳米的最终分辨率; 2、由于其低功率消耗,SRRF stream技术特别适用于活细胞成像,不会对细胞造成损伤; 3、SRRF stream算法使得活细胞的超分辨率成像成为可能,以每秒10帧的速率捕获超越衍射极限的图像,为细胞生物学研究提供了前所未有的洞察力。 |
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