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利用光可切换蛋白实现对细胞信号传导的时空控制 

作者: Dr Mark Browne and Dr Alan Mullan

尽管基于荧光报告蛋白(如GFP)已经让我们对细胞及其蛋白有了很多了解,但科学家们仍渴望探索更多。越来越多的研究人员不仅利用光来观察细胞功能,还利用光以极高的精度控制细胞功能。这种对细胞功能的光学操控被应用于前沿研究中,以控制生物体的行为、表征信号传导通路以及测试细胞网络模型。这种方法被称为“光遗传学”,并于2010年被《自然》杂志评为“年度方法”。自那以后,光遗传学工具被越来越多的研究团队使用,并在神经科学及其他领域得到广泛应用。

来自加州大学旧金山分校的研究人员利用植物的光敏色素信号网络,开发了一种基因编码的光控系统,用于对蛋白进行精细的时空控制。光刺激设备Mosaic是光学装置的关键部分,它使得研究人员能够在哺乳动物细胞中实现蛋白募集的紧密空间模式。光敏色素是植物中的一种感光信号蛋白,它通过检测红光和近红外光来控制许多光敏过程。研究人员在对光敏色素B(PhyB)和光敏色素互作因子3(PIF3)优化后产生了一个光敏对Phy-PIF,该复合体在红光(650nm)照射下结合,在红外光(>750nm)照射下解离。当PhyB固定在细胞膜上时,可以观察到荧光标记的PIF3在650nm光照下转移到质膜上并形成Phy-PIF复合体。

研究人员利用MicroPoint光刺激系统局部诱导荧光标记的Phy-PIF的募集来测试光可切换的蛋白对。该系统能够实现接近衍射极限的几何形状的激光照明,并实时观察激光照射。通过将来自紫外泵浦的罗丹明650 nm染料激光器的650 nm光以20 Hz的频率连续脉冲照射在质膜区域,而整个细胞暴露于来自过滤明场光源的抑制红外光下。鉴于全内反射荧光(TIRF)成像能够对细胞膜附近的薄层区域进行成像,他们便能够进一步判断招募的荧光团是在膜中还是细胞质中。

随后,研究人员开发了一种全自动方法,用于将细胞同时暴露于两种波长的光。“开发光学装置的主要挑战在于同时产生红色和红外光的反向图案。“研究团队成员Orion Weiner博士表示:”为了对抗质膜结合的PIF-YFP的侧向扩散,我们需要一个由红光招募的区域,周围被红外光包围的反向区域。”为此,研究人员与Photonic Instruments合作开发了“互补马赛克主动照明系统”,该系统将红光与装置镜子的“开启”状态耦合,将单独的红外光源与镜子的“关闭”状态耦合。在这种配置下,该装置既能“靶向”用户定义区域内的活动,又能“沉默”这些区域外的活动。

Mosaic,包含一个由数以万计的基于半导体的微镜阵列,被称为数字微镜器件(DMD)。这些铰接式微镜可以非常快速地有效独立倾斜,从而同时产生红色像素和红外像素的反向图案。“这种同时生成红色和红外光的反向图案的能力是独一无二的,没有其他商业设备能够做到这一点。”正如Weiner所说,“这对于我们利用Phy/PIF系统在哺乳动物细胞中生成紧密的空间蛋白招募模式至关重要。”

研究人员利用Mosaic Duet系统,甚至可以将简单的像素化视频投影到细胞膜上。通过全内反射荧光显微镜(TIRF)成像技术,并使用Andor iXon EMCCD相机对细胞膜进行成像,结果显示,该系统能够产生小至3微米的特征。iXon相机允许他们尽可能少地使用荧光激发光,这是可取的,因为成像波长也会轻微激活光可激活系统,研究团队负责人Anselm Levskaya表示。

研究人员还可以利用软件来对目标掩模中的平均红光强度进行“抖动”处理,从而能够平滑调节活性Phy的比例,并招募PIF-YFP。这表明该技术可用于实现化学势的“灰度”控制。

研究人员开发的这种光可切换的遗传编码Phy-PIF相互作用模块具有可调节且可逆的相互作用,能够用于控制任何依赖招募事件的活细胞过程。由于光可以实现高时空分辨率的控制,因此Phy-PIF模块能够驱动高度复杂的时空模式来调控细胞过程。

该研究小组还一直在使用闭环控制系统来自动调节光调节信号转导通路的激活。Levskaya表示,这对于使用单细胞进行定量显微成像的实验很重要。他们预计Phy-PIF模块可用于控制各种细胞的生物学过程,而无需逐个案例进行蛋白质工程。

我认为该系统最大的应用之一将是干扰发育动物中的基因转录和信号转导通路。“Levskaya说到:”能够在时间和空间上改变信号和基因的表达,将使我们能够在发育过程中开展非常新颖的实验,以尝试建立动物在体机制的逆向工程。

Mosaic和MicroPoint都是Andor光刺激产品系列的一部分。这些工具自开发以来,帮助许多研究小组利用光遗传学技术,在神经科学的诸多领域,以及更广泛的遗传调控和调节领域,取得了重要进展。

Spatiotemporal Control

1

A - 光可逆招募系统由膜靶向的光敏色素组成,这些光敏色素可以通过红光(650nm)激活,并通过近红外光(750nm)失活。膜结合的光敏色素池被激活时,自由扩散的黄色荧光蛋白(YFP)标记的PIF会迅速吸附至质膜上。在失活时,则会被释放回细胞质中。 B - 通过设计红光和红外光的空间模式,可以精确控制膜上活性光敏色素的分布,从而允许YFP-PIF在空间上靶向招募到特定的亚细胞位置。

Spatiotemporal Control

2

PIF-YFP通过一个红色光束和一个红外光的反向掩模实现在NIH 3T3细胞膜上的募集。右侧展示了当红色光开关时,PIF-YFP从膜上的移位和释放。感谢加州大学旧金山分校的Anselm Levskaya, Orion D. Weiner, Wendell A. Lim和Christopher A. Voigt对本研究工作的贡献。

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