基于共聚焦显微镜理解听力障碍-可视化毛细胞动态活动 

基于牛津仪器Andor Dragonfly可视化毛细胞动态

作者： By Claudia Florindo & Dr Emma Kenyon

英国约有五分之一的成年人失聪或患有某种程度的听力损失。 听力障碍使得沟通困难，并可能导致社交孤立和抑郁加剧。 由于口罩和社交距离使沟通变得更加困难， 新冠肺炎疫情对听力损失患者的影响尤为严重。此外，一些研究表明，听力损失与痴呆症之间存在关联，轻度听力损失可能使患痴呆症的风险增加一倍，而严重听力损失患者的风险则增加至五倍。

听力损失有几个潜在原因，包括年龄、噪音、遗传、疾病和某些治疗药物。能够导致耳损伤的药物被称为“耳毒性”，氨基糖苷类抗生素是其中之一。氨基糖苷类药物是用于治疗危及生命的细菌感染的，如败血症和耐多药结核病，然而不幸的是，其副作用会损害内耳的感觉毛细胞，导致听力受损和平衡障碍。

内耳的毛细胞之所以如此命名，是因为它们的顶端有细小的毛发状突起，称为纤毛，这些突起会响应声音振动而移动。毛细胞将静纤毛的机械运动转化为电信号，我们的大脑将其解释为声音（例如语音和音乐）。在人类和其他哺乳动物中，毛细胞不能再生，一旦丢失则永远无法被挽回。因此，听力损失是不可逆的，这就使得这一领域的研究非常重要。

在本文中，我们为您介绍：

• Andor Dragonfly共聚焦系统在以下研究中的解决方案的概述： 
  • 细胞内转运成像；
  • 极化上皮细胞研究。
• 研究聚焦——揭示感觉毛细胞的胞内运输

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图 1 - 来自 pou4f3 GFP 转基因幼年斑马鱼后侧线毛细胞。毛细胞表达青色的绿色荧光蛋白 (GFP)，并正在被洋红色的Texas-Red庆大霉素 (TRG)标记。TRG 已添加到幼虫所处的培养基中，此时（添加 TRG 后 3 分钟），只有动纤毛和静纤毛被 TRG 标记。使用 Andor Dragonfly 进行细胞成像。A) 毛细胞重叠的最大强度投影 (MIP)图； B) 毛细胞3D成像的旋转展示。使用 Imaris 软件对毛细胞的3D成像进行 MIP 和 3D 可视化。

基于Andor Dragonfly成像极化上皮细胞

极化上皮细胞的研究需要各种实验方法，光学显微镜就在其中发挥着重要的作用。

为了可视化细胞内的动态运输，成像系统必须具备进行温和实时成像以及高速图像采集的能力。当然，一个具有出色的背景抑制能力的高灵敏系统也是必不可少的。此外，系统还应支持跨尺度的成像，从亚细胞结构到组织、器官或生物体水平（图 1 为活斑马鱼幼虫毛细胞成像），这将使研究人员能够了解亚细胞动态如何影响组织、器官或生物体。

Andor Dragonfly具有非常适合极化上皮成像的卓越特性。其高采集速度和实时 3D 渲染能力允许快速成像和可视化，而不损失分辨率。该系统可以实现高达每秒 400 帧的成像。对于在器官或生物体中对这些细胞进行概览，大视场结合Borealis均匀照明可以实现无缝拼接，支持在任何尺度上进行即时可视化。

我们询问 了Kenyon 博士，为什么 Andor Dragonfly 是理解感觉毛细胞胞内运输的关键工具？

Dr. Kenyon replied that:

Kenyon博士回答说：“Andor Dragonfly 在这方面（研究毛细胞中的转运）非常有优势。尤其是氨基糖苷类物质在斑马鱼毛细胞胞内的转运发生在一个较短的时间内，需要快速的图像采集。此外，标记细胞内区室的染料特别容易发生光漂白，使用Dragonfly成像则可以大大改善这种情况。" 

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图2 - 体外小鼠耳蜗培养中的外毛细胞。毛细胞用青色的溶酶体绿色荧光（LysoTracker green）和洋红色Texas-red庆大霉素标记。使用 Oxford Instruments – Andor Dragonfly对细胞进行成像。使用 Imaris 软件对毛细胞进行 3D 旋转。

研究聚焦-了解感觉毛细胞的胞内转运

Emma Kenyon博士是由英国皇家聋人协会（RNID）资助的独立研究员。Kenyon博士所在的实验室位于苏塞克斯大学生命科学学院神经科学系的Kros/Richardson实验室。该实验室致力于了解内耳的工作原理和发育，致力于揭示导致听力丧失和平衡障碍的主要原因。

Kenyon博士的研究专注在拯救生命的耳毒性药物如何导致耳聋和平衡障碍。更具体地说，她专注于氨基糖苷类抗生素（例如庆大霉素、卡那霉素）损伤感觉毛细胞的机制。Kenyon博士研究的目的是保护毛细胞免受这些耳毒素的侵害，并保护需要这些药物的患者的听力。

Kenyon博士的研究特别关注感觉毛细胞的胞内运输，以及氨基糖苷类药物进入细胞后的运输方式。为了回答其问题，Kenyon 博士将荧光团 (Texas Red) 与多种不同的氨基糖苷类药物结合。然后使用荧光显微镜在斑马鱼侧线的感觉毛细胞和小鼠耳蜗培养物中追踪这些药物。斑马鱼侧线含有与哺乳动物内耳 (耳蜗) 相似的毛细胞，但由于它们位于鱼的表面，因此可以使用荧光显微镜对它们进行活体成像，而无需额外的组织准备。斑马鱼侧线和小鼠耳蜗培养物是这项研究的互补模型，但它们也面临着挑战：

• 细胞内运输的可视化需要活细胞成像和高空间和时间分辨率的快速图像采集。
• 成像需要在低曝光下进行，以避免光毒性和光漂白。
• 准确可视化抗生素的细胞内位置需要较高的背景抑制和灵敏度。
  

Kenyon博士的实验涉及在活斑马幼鱼或小鼠耳蜗培养物的毛细胞中对Texas-red结合的庆大霉素进行荧光共聚焦成像。毛细胞用靶向细胞器的染料进行标记，并在设定的时间点拍摄图像。 在斑马鱼模型中，每5分钟对毛细胞进行成像，持续长达80分钟（图1），而小鼠培养是在2、4、16和24小时拍摄图像（图2和3）。 这些实验允许跟踪庆大霉素的运动，并可视化它们可能以及何时被运输到哪些细胞内隔室。

图 4 - 体外小鼠耳蜗培养物中的外毛细胞的正交截面。为了分析毛细胞，Kenyon 博士利用 Imaris 软件的正交视图在所有平面上可视化Texas-red庆大霉素的分布，并与溶酶体绿色荧光（LysoTracker green）的分布进行比较。毛细胞用溶酶体绿色荧光（青色）和Texas-red标记庆大霉素（洋红色）。使用 Oxford Instruments - Andor Dragonfly 对细胞进行成像。

我们向 Kenyon 博士询问了她对牛津仪器Andor Dragonfly的最终评价：

“我非常喜欢该系统的快速启动和关闭功能，这使其非常适合即兴实验。”

该项目资助至 2021 年底。

• Kenyon博士致力于阐明感觉毛细胞的胞内运输途径。具体而言，研究氨基糖苷类药物的运输机制。
• 预期目标是揭示可以利用的途径，以保护毛细胞免受耳毒性药物的损害。最终目标是促进开发能够有效治疗感染但不会增加听力损失和可能相关的痴呆症风险的药物。

参考文献：

1. Kenyon, E.J. et al. Identification of a series of hair-cell MET channel blockers that protect against aminoglycoside-induced ototoxicity JCI Insight. (2021) 6 (7):e145704
2. O’Reilly M. et al., Design, Synthesis, and Biological Evaluation of a New Series of Carvedilol Derivatives That Protect Sensory Hair Cells from Aminoglycoside-Induced Damage by Blocking the Mechanoelectrical Transducer Channel Med. Chem. 2019, 62, 11, 5312–5329
3. Kenyon, E.J. et al. Identification of ion-channel modulators that protect against aminoglycoside-induced hair cell death JCI Insight. (2017); 2 (24):e96773.
4. Browne M., (2017) Twelve Reasons Why Your Next Confocal Should Be Dragonfly.
5. Kenyon Instagram account - pictures of lab workday

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