通过光抑制特定神经元揭秘大脑的复杂性 

科学家们可以利用“光开关”的蛋白质研究大脑等复杂网络中特定神经元的功能。光遗传学（Optogenetics）在神经科学中已被证明极为有效，其精确度远高于以往的电刺激方法。光可以高度可控地激活或关闭”光开关“，精确控制特定细胞的活动，进而观察特定神经元群体如何改变神经行为。

HyLighter：一种快速光开关的开发

神经元中的过程发生得非常快，因此速度是许多研究的关键参数。细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）和HaloR家族是光激活的抑制蛋白，能够实现毫秒级分辨率。尽管它们非常有效，但仍有改进空间。例如，两者都需要持续光照才能保持激活状态，而持续光照可能导致其他问题，如反弹激发或最终部分失活。此外，HaloR 电流的大小是由泵浦循环的恒定激活驱动的。它可能需要高的光强度。

故而，由加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的Ehud Y. Isacoff教授领导的研究团队设计了一种光控的配体门控离子通道，该通道选择性地通过K⁺，并命名为HyLighter。HyLighter在光暴露前不活跃，对光的敏感性高于HaloR，并且可以在较宽范围的光强度下达到最大电流。

光激活离子通道能够将光脉冲转化为稳定的超极化电流，这种电流在没有光照的情况下可以保持激活状态，直到使用互补波长的光将其关闭。该通道基于离子型谷氨酸受体（iGluR），这类阳离子通道在高等生物中传递兴奋性神经信号，并且对Na⁺和K⁺均有通透性。

为了开发HyLighter，研究人员首先设计构建了具有 iGluR6 配体结合结构域的嵌合 iGluR（iGluR6 是光开关栓系配体附着位点，在兴奋性 LiGluR 通道中编码光敏性）以及 sGluR0 （一种外来细菌 iGluR 同系物）的孔。他们对这些构建的嵌合体进行实验，发现其中一种具有他们所需的所有特性：它可以作为光控钾离子通道，能够在~390 nm波长的低光强下实现最大激活，在黑暗中保持活性，并且可以通过500 nm波长的光将其关闭。

图1 - 离子型谷氨酸受体（左上）和一种成为马来酰亚胺-偶氮苯-谷氨酸（MAG；下图）的光合成开关是光控HyLighter离子通道（右）的基础。图片由Harald Janovjak博士提供。

研究人员通过生物基因转移技术将HyLighter-GFP转染到新生大鼠的海马切片中进行测试。HyLighter在海马的所有区域均有良好的表达，并在神经元的各个部分均匀分布。使用与显微镜连接的Lambda DG-4光源发出的390nm激光照激活HyLighter，并通过Mosaic系统和40x物镜将激光投射到样本上。

“在现有的显微镜解决方案中，只有Mosaic能够在成像视野中持续照亮任意的掩模。激光扫描显微镜因无法提供真正的同时照明而无法做到这一点。这一重要特性，再加上易用性和与软件的直接接口，使得Mosaic成为了光遗传学界独特且有价值的工具。”研究团队成员Harald Janovjak博士（现任职于澳大利亚再生医学研究所，莫纳什大学）这样说到。

在海马切片中，HyLighter诱导了强烈的超极化，能够沉默神经元放电，直到被500nm的激光灭活。在样本中，390nm处的激光强度约为20mW/mm-2，每平方毫米，500nm处的激光强度约为40mW/mm-2。

图2 - HyLighter：GFP与非特异性tdTomato的共聚焦堆栈成像的MIP图。注意：细胞中广泛存在（黄色）HyLighter GFP，当用390nm脉冲激光照射时可用于沉默神经元，而用500nm的脉冲激光照射可使K⁺通道失活。

图3 - 当 HyLighter 被 390 nm 光（紫色条带）激活时，由电流触发的动作电位被强烈抑制，而当 HyLighter 被 500 nm 光（绿色条带）抑制时，动作电位不再被抑制。

转基因斑马鱼模型中的双波长设计研究

研究人员还构建了表达HyLighter的转基因斑马鱼模型。当鱼的尾部接受390nm激光时，机械刺激后的逃逸反应概率降低。这一现象可在500nm激光照射后逆转。而在不表达HyLighter的斑马鱼中，光照对逃逸反应没有影响。研究人员表示，作为一种新型的光激活、纯超极化离子通道，HyLighter对现有的光遗传学工具进行了补充。其推拉双波长设计、低光需求和独特的光谱灵敏度使其成为一种能够在完整神经回路中以时间精度抑制特定细胞的活动的有用的策略。此外，双波长设计意味着它可以在光照后沉默神经元，进而在环境光或黑暗中进行行为分析，避免受到视觉刺激的影响。

Janovjak博士说：“在神经元沉默研究中，双稳态和对光的小需求使HyLighter独一无二。”

HyLighter和其它天然和合成的光学荧光蛋白已经帮助解决了神经生物学中的许多关键问题。

衷心感谢澳大利亚再生医学研究所的Harald Janovjak博士和加州大学伯克利分校的Ehud Isacoff博士。

相关阅读：

• A light-gated, potassium-selective glutamate receptor for the optical inhibition of neuronal firing, Janovjak H., Szobota S., Wyart C., Trauner D., Isacoff EY. Nature Neuroscience 13, 1027–1032 (2010) https://doi.org/10.1038/nn.2589
• Optical highlighter molecules in neurobiology, Datta SR, Patterson GH. Current Opinion in Neurobiology. Volume 22, Issue 1 (2012). Https://doi.org/10.1016/j.conb.2011.11.007
• Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints, Wiegert JS, Mahn M, Prigge M, Printz Y, Yizhar O. Neuron, Volume 95, Issue 3 (2017) Pages 504-529, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.06.050

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