囊泡运输专家访谈 

Dr. Kazuaki Yoshioka是日本金泽大学医学研究生院生理学系（拓和康教授实验室, Prof. Yoh Takuwa’s Lab）的专职研究员。

Dr. Kazuaki Yoshioka在东京农工大学松冈秀明教授的实验室获得博士学位。随后，他在美国生物分析系统公司（BASi）担任博士后研究员，之后转至东京都医学科学研究所担任第二位博士后研究员。目前，Dr. Kazuaki Yoshioka的研究重点聚焦于囊泡运输领域。

Dr. Kazuaki Yoshioka致力于解析PI3激酶（磷脂酰肌醇3激酶）在囊泡运输中的作用，以及其在正常体内平衡和疾病中的重要性。截至本文发表时，他拥有出色的学术论文发表记录，在Web of Science中57篇论文的H指数达27，总被引次数1862次。

鉴于Dr. Kazuaki Yoshioka在囊泡运输领域的前沿研究，我们希望了解其研究的源动力，以及他为解答科学问题需克服的挑战。以下是关于他近期研究挑战与发现的访谈内容。

问题1：您为何对囊泡研究产生兴趣？

我们长期研究II类磷脂酰肌醇3激酶（PI3K-C2α）在血管生物学中的生理基础。2012年，我们在《Nature Medicine》发表论文，发现PI3K-C2α是VEGF（血管内皮生长因子）、S1P（鞘氨醇-1-磷酸）、TGFβ（转化生长因子-β）等膜蛋白受体内吞作用的必需因子，以调控血管屏障功能。基于此，我们对PI3K-C2α调控内吞囊泡形成的分子与细胞机制产生浓厚兴趣。

问题2：囊泡成像的主要挑战是什么？

希望在活细胞中实现多色（3-4色）、高速（间隔<500毫秒-1秒）、高分辨率的活细胞内吞事件观察。

了解全内反射荧光显微镜（TIRF）是观察细胞表面内吞动态的最佳选择之一。但我们需要追踪囊泡从早期/晚期内体到溶酶体的完整路径。遗憾的是，TIRF仅能对亚细胞表层的内吞初始事件进行成像。

问题3：为解答研究问题，囊泡成像需要何种分辨率？

我们需要高分辨率以观察网格蛋白包被囊泡（CCVs）。CCVs形成涉及发动蛋白、衔接蛋白-2（AP-2）、肌动蛋白纤维、磷酸肌醇等多种分子。为在内吞事件中区分这些分子，我需要获取50-100纳米分辨率的多色三维活细胞成像数据。

问题4：为何牛津仪器的超分辨径向波动（SRRF-Stream）成像技术对解决您的挑战如此重要？

因为SRRF-Stream结合了牛津仪器Dragonfly（转盘共聚焦）/iXon EMCCD相机具有低光毒性特性，可将传统共聚焦显微技术拓展至长时间多色通道Z轴层扫成像。

问题5：您需要何种采集速度？

我们以约10-15秒的间隔采集活细胞的SRRF-Stream图像（2色，3层Z轴扫描）。

问题6：样本是否会发生光漂白？

光漂白程度很低，比我预期的好很多。由于我此前使用过横河CSU + iXon EMCCD系统，因此我了解相比于其他转盘共聚焦系统，Dragonfly所具有的独特优势。

问题7：如您所述光漂白水平极低，是否归因于使用转盘共聚焦系统？

是的。通常，转盘共聚焦系统不仅能实现高速成像，还因减少激光照射而显著降低光毒性和光漂白。传统问题在于捕获图像偏暗，但通过iXon EMCCD等高灵敏度相机可解决这一难题！

因此，Dragonfly实际上是低光漂白活细胞成像的最佳选择。

问题8：转盘共聚焦系统相较点扫描系统有何优势？

盘共聚焦系统相较传统点扫描系统主要具备两大优势：“高速”和“更低的光毒性与光漂白”。

问题9：点扫描系统和宽场系统中的样本光漂白严重吗？

是的，非常严重。我从不使用这些系统进行活细胞成像。

问题10：为何您选择Dragonfly而非现有的其他品牌的转盘共聚焦系统？Dragonfly的哪些优势促使您做出这一选择？

Dragonfly和CSU系统均为优秀的活细胞成像系统。但我们的横河系统（CSU10 + iXonEMCCD DV887）已属旧配置，其分辨率和灵敏度不足一直困扰我们。而牛津仪器的Dragonfly解决了这些问题，最棒的是它能直接提供超分辨率图像。

问题11：TIRF与SRRF-Stream的联用对您的研究是否有帮助？

是的，我希望能实现。我认为Dragonfly的SRRF-Stream与TIRF成像联用的活细胞成像将成为影响生命科学领域的最强系统。

问题12：Dragonfly的哪些功能对您的研究帮助最大？

当需要确定目标分子的亚细胞定位时，Dragonfly支持多色（DAPI、GFP、RFP及远红通道）三维成像，并可在持续高分辨率（共聚焦）、宽场成像模式与超分辨率（SRRF-Stream）放大视野模式间切换。从实际应用来看，其功能堪称卓越！

问题13：在数据采集过程中有没有令您特别难忘的时刻？

Dragonfly在分辨率和速度间实现了近乎完美的平衡，这令我印象深刻。它可适用于从单个活细胞到整个组织切片的多种生物样本。

问题14：是否有其他补充？
我爱Dragonfly。为何还要选择旧的显微镜？

点击此处阅读关于Dr. Kazuaki Yoshioka研究工作的应用笔记。

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